ELISA，即酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种在免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的免疫酶检测技术。成功实施ELISA的关键在于选择合适的试剂和耗材，通过了解这些材料的特性与多样性，可以在不同实验需求中找到最佳组合，从而开发出高质量的ELISA方法。

一、酶标板材

市面上常见的酶标板多由聚苯乙烯（C8H8）构成，且各厂家会根据不同的化学修饰提供多种型号。普通酶标板通常根据高结合力（High binding）和中结合力（Medium binding）进行分类。而根据笔者的经验，更倾向于将其划分为亲水、弱亲水、未处理和疏水四个等级。一般而言，酶标板从亲水到疏水，蛋白质结合能力也逐渐降低。例如，亲水板材的最大吸附量为220ng，而疏水板材则为100ng。此外，随着疏水性的增强，板材对样品中非特异性物质的吸附能力也会提升，这可能引发非特异性信号。因此，专注于ELISA方法多样化开发的实验室应准备多种不同特性的酶标板材供选择。

二、包被液

常用的包被液包括PBS（pH 7.4）和碳酸钠-碳酸氢钠溶液（pH 9.6）。包被液的pH值和离子浓度会影响包被效率，因此需根据包被蛋白的特性进行选择。在包被过程中，并不是所有蛋白都会吸附在酶标板上，大部分蛋白仍会留在溶液中。有研究表明，通过抽真空可使包被蛋白在酶标板上以更高密度吸附。

三、封闭剂

常用的封闭剂包括3%BSA（w/v）和5%脱脂奶粉（w/v）。封闭剂的作用在于覆盖酶标板上未被包被蛋白占据的位置，以防止后续样品或酶联抗体的非特异性吸附。笔者经验表明，封闭剂对成分简单的样品有效，但在面对复杂样品时，其封闭效果会降低。研究显示，封闭剂的效果与分子大小呈反比，因此选择分子量较小的封闭剂（如酪蛋白）可能会取得更好的效果。特别需要注意，若检测体系为生物素-链霉亲和素体系，请避免使用脱脂奶粉作为封闭剂，因为其可能含有生物素，导致干扰。

四、洗涤液/稀释液

常用的洗涤液为中性缓冲液结合一定浓度的去污剂，如PBST（0.05% Tween-20 in PBS）。稀释液中通常加入一定的封闭剂，如0.5%BSA (w/v) in PBST。在一些体内样品检测中，稀释液中添加适量阴性血清，以确保不同稀释度的样品具有相似的非特异背景。

五、酶联抗体

酶联抗体根据抗体的作用位点可分为特异性酶联抗体和通用型酶联抗体。特异性酶联抗体用于识别特定蛋白的表位，而通用型酶联抗体则针对多肽序列组成的标签、特定物种抗体的Fc端等。常用的酶联抗体标记的酶有碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化氢酶（HRP）。根据抗体成分，酶联抗体可以分为单克隆和多克隆，其中多克隆酶联抗体成分复杂，使用时需特别注意与ELISA其它试剂的相互作用。

六、显色液和酶标仪

显色液的选择需与酶联抗体的酶种类相匹配，并与实验室的酶标仪兼容。如果酶联抗体使用HRP，可采用TMB显色液，利用具备吸光度检测功能的酶标仪进行检测；或者使用Ampliflu™Red作为底物，利用拥有荧光检测功能的仪器；又或者选用QuantaRed ADHP作为底物，结合能够进行化学发光读数的仪器。通常，ELISA方法的灵敏度受到底物的检测方法限制，其中化学发光底物检测的下限优于荧光底物，更优于吸光度底物。因此，在实验开发过程中，应根据具体情况合理选择不同显色强度的TMB显色液。

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